Sci Adv︱重磅！DNA甲基化蛋白DNMT1突变可诱发神经退行性疾病
撰文︱赵性森
责编︱王思珍
在哺乳动物中，DNA甲基化是一种关键的表观遗传学修饰，它在基因表达调控、亲本印记、X染色体失活、胚胎发育、神经发生、细胞重编程等过程中起到重要作用【1-5】。DNA甲基转移酶1（简称DNMT1），又被称为DNA甲基化维持酶，它在DNA复制过程中负责把基因组上半甲基化的DNA转化为完全甲基化的DNA【6】。
HSAN1E病（hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1E with dementia and hearing loss）和ADCA-DN病（autosomal dominant cerebellar ataxia, deafness, and narcolepsy）是两种神经退行性疾病，由常染色体显性遗传的DNMT1基因杂合突变诱导产生，HSAN1E病表现为遗传性的感觉自主神经病变并且伴有痴呆和听力丧失，ADCA-DN病表现为小脑共济失调、耳聋和发作性睡病（嗜睡症）。在HSAN1E和ADCA-DN的病人中，他们携带的DNMT1基因的杂合突变位点定位在RFTS（the replication foci targeting sequence）结构域，DNMT1的RFTS结构域参与DNMT1对复制叉和着丝粒染色质的靶向【7-10】。尽管有研究发现RFTS结构域突变会影响DNMT1蛋白的功能，然而，到目前为止，这些突变如何影响体内DNMT1并因此导致神经退行性疾病的产生，机制尚不清楚。
2021年9月1日，华东师范大学的翁杰敏教授团队与浙江大学的李学坤教授团队合作在《Science Advances》上在线发表了题为“Mutation-induced DNMT1 cleavage drives neurodegenerative disease”的研究论文。研究人员构建了模拟HSAN1E病人携带的的两种DNMT1基因突变Y495C和D490E-P491Y的基因敲入小鼠模型Dnmt1-M1以及Dnmt1-M2，发现这两种小鼠表现出了学习记忆障碍的神经退行性疾病表型，并揭示了DNMT1蛋白的RFTS结构域突变导致神经退行性病变的可能发病机制。
研究团队首先构建了两种携带与HSAN1E疾病相关的DNMT1基因突变小鼠Dnmt1-M1以及Dnmt1-M2，这两种纯合突变的小鼠在胚胎10.5天左右死亡，杂合子则可以存活、可育并且在生长和外观上没有明显异常（图1）。Dnmt1-M1和Dnmt1-M2杂合子小鼠的DNMT1蛋白水平比正常野生型（WT）小鼠相比减少约50%。研究团队检测了WT和突变体小鼠胚胎及成体小鼠组织中DNA甲基化的水平，发现杂合子胚胎及成鼠组织中 DNA 甲基化水平下降3%-4%左右，这与报道的HSAN1E病人中DNA 甲基化下降的水平相一致（图1）。
图1. DNMT1的RFTS突变的纯合子胚胎致死。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
图2. 两种基因突变敲入的杂合子的DNMT1蛋白水平以及DNA甲基化水平降低。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
为了探究DNMT1突变小鼠在神经退行性疾病方面的表型以及发病机理，研究团队分离培养了WT和DNMT1-M2小鼠的成体神经干细胞（aNSCs）。体外实验发现DNMT1-M2神经干细胞增殖能力降低，分化产生的神经元数目减少，星形胶质细胞增加。体内BrdU标记实验也发现DNMT1-M2神经干细胞的增殖能力降低。水迷宫以及八臂迷宫等行为学实验发现DNMT1-M2小鼠表现出较差的学习记忆能力。这些实验结果表明DNMT-M2小鼠成体神经发生出现异常，认知功能下降。这与HSAN1E病人所表现的认知障碍表型一致（图3）。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
为了揭示Dnmt1-M1和Dnmt1-M2小鼠中的DNMT1蛋白水平下降的原因，研究团队制备了野生型、杂合和纯合的Dnmt1-M1小鼠胚胎干细胞并进行分析，发现在DNMT1突变的胚胎干细胞中，DNMT1的蛋白水平降低。对胚胎干细胞分别用蛋白酶体抑制剂MG132以及溶酶体抑制剂CQ处理，发现这两种抑制剂都不能让Dnmt1-M1纯合子的DNMT1蛋白水平回升到与对照小鼠同等水平（图4）。这说明：尽管突变的DNMT1蛋白与WT相比确实不稳定，但并不是通过蛋白酶体或溶酶体途径降解。
图4. 突变的DNMT1蛋白在纯合子突变的胚胎干细胞中稳定性下降。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
研究团队用DNMT1的N端区特异性抗体从Dnmt1+/+和Dnmt1M1/M1突变小鼠胚胎干细胞（mESc）中进行免疫沉淀实验，在Dnmt1M1/M1及Dnmt1+/M2细胞裂解液中检测到分子量约为75-80 KDa的DNMT1截短蛋白，而在WT细胞裂解液中不存在。这解释了突变小鼠胚胎、突变的mESc和杂合小鼠中DNMT1蛋白水平的降低。研究团队对WT及Dnmt1突变细胞中DNMT1的定位也进行了检测，发现突变的mESc、MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）以及aNSCs中 DNMT1蛋白没有细胞质聚集，但存在明显核仁错误定位的现象（图5）。
图5突变的DNMT1蛋白具有特殊的蛋白水解方式以及核定位错误。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
为了进一步确定核仁定位的DNMT1是全长的DNMT1突变体还是DNMT1的截短体，研究团队构建了一系列表达不同长度DNMT1 N端结构域的质粒，并对过表达的DNMT1蛋白截短体及全长的DNMT1突变体在HeLa细胞中的定位进行了检测。结果显示DNMT1截短体蛋白能够部分定位到核仁，但全长的DNMT1突变体未检测到错误定位（图6）。这表明DNMT1突变细胞中观察到的核仁定位的DNMT1蛋白最有可能是DNMT1截短体。对Dnmt1突变小鼠及鼠源细胞的研究表明，突变的DNMT1蛋白被蛋白酶裂解是导致HSAN1E神经退行性疾病中DNMT1功能缺陷的潜在机制。为了在人源细胞中进一步验证，研究团队通过ABE-MAX单碱基编辑技术在神经胶质瘤HS683细胞中构建DNMT1-M1突变的细胞系。结果显示，被编辑的HS683细胞增殖受阻并表现出DNMT1蛋白核仁定位（图6）。然而，在HeLa细胞中构建的DNMT1-M1点突变细胞中没有检测到截短体蛋白，并且突变的DNMT1蛋白在亚细胞定位、蛋白稳定性和DNA甲基转移酶活性方面基本正常（图7）。
这些研究结果表明，RFTS结构域突变引起的DNMT1降解，而不是突变本身，导致了DNMT1突变体功能的缺陷。基于上述两种神经退行性疾病病人中均只发现DNMT1的RFTS区域的错义突变（missense mutation）而没有发现存在该区域及其它区域的无义突变（nonsense mutation）的病人, 因此作者提出，造成上述神经退行性疾病的原因一方面是突变DNMT1蛋白的特异剪切导致其DNA甲基化活性的缺陷，另一方面是其相应截短体的异常核仁局部定位可能干扰了细胞核仁的正常功能（如核糖体RNA转录），最终可能导致一些神经细胞发育分化的缺陷与凋亡，从而导致相关的神经退行性疾病。
图6 DNMT1 截短体存在核定位异常以及DNMT1-M1突变的细胞系的构建。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
图7. 突变的 DNMT1 蛋白在亚细胞定位、蛋白稳定性和 DNA 甲基转移酶活性等特性与野生型蛋白没有明显差别。
（图片引自：W. Wang et al., Science advances, 2021）
1．DNMT1纯合子突变致死的原因是由DNMT1蛋白含量显著减少而产生的DNA甲基化缺陷所导致的。
2. DNMT1杂合子突变小鼠存在神经发生的紊乱和学习记忆功能障碍。
3. DNMT1突变蛋白存在特殊的蛋白水解方式。
4. DNMT1截短体而不是突变体存在细胞核定位异常，并可能是导致HSAN1E疾病的关键因素。
综上所述，HSAN1E病人中发现的DNMT1突变体本身的性质与野生型DNMT1相比差异不大，主要由于突变体被特殊蛋白酶裂解导致其不稳定、蛋白水平和DNA甲基化水平下降并产生错误定位的截短体，影响基因转录和细胞功能从而导致疾病的产生。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe8511
华东师范大学的翁杰敏教授、浙江大学的李学坤教授为论文的共同通讯作者，华东师范大学的王文偲博士、浙江大学的博士研究生赵性森为论文的共同第一作者。该项工作得到国家自然科学基金项目的资助。
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制版︱王思珍
本文完